ערכת PCR ישירה של רקמות עכבר

תבנית A-1

■ התבנית מכילה זיהומי חלבון או מעכבי טאק וכו '—— לטהר תבנית DNA, להסיר זיהומי חלבון או לחלץ DNA תבנית עם ערכות טיהור.

■ גילוי התבנית אינו שלם —— הגדילו את טמפרטורת הדנטורציה כראוי והאריכו את זמן ההפנמה.

■ התדרדרות התבנית —— הכינו מחדש את התבנית.

A-2 פריימר

■ איכות ירודה של פריימרים —— סינתזה מחדש של הפריימר.

■ הפחתת פריימר —— חלקו את הפריימרים בריכוז גבוה לנפח קטן לשימור. הימנע מהקפאה והפשרה מרובות או קריו-שימור לטווח ארוך של 4 מעלות צלזיוס.

■ תכנון לא נכון של פריימרים (למשל אורך פריימר לא מספיק, דימר נוצר בין פריימרים וכו ') -עיצוב פריימרים מחדש (הימנע מהיווצרות דימר פריימר ומבנה משני)

A-3 Mg²⁺ריכוז

■ מג²⁺ הריכוז נמוך מדי —— הגדל כראוי Mg²⁺ ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-4 טמפרטורת חישול

■ טמפרטורת החישול הגבוהה משפיעה על כריכת הפריימר והתבנית. —— הפחית את טמפרטורת החישול וייעל את המצב בשיפוע של 2 ° C.

זמן הארכה A-5

■ זמן הארכה קצר —— הגדל את זמן ההארכה.

תופעות: דגימות שליליות מציגות גם את להקות רצף היעד.

זיהום A-1 של PCR

■ זיהום צולב של רצף המטרה או מוצרי ההגברה —— בזהירות לא להעביר את המדגם המכיל את רצף המטרות בדגימה השלילית או לשפוך אותן מהצינור הצנטריפוגות. יש לבצע חיטוי של הריאגנטים או הציוד כדי לסלק חומצות גרעין קיימות, ולקבוע את קיומה של זיהום באמצעות ניסויי בקרה שליליים.

■ זיהום מגיב —— סלק את הריאגנטים ושמור בטמפרטורה נמוכה.

A-2 פרייםr

■ מג²⁺ הריכוז נמוך מדי —— הגדל כראוי Mg²⁺ ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

■ עיצוב פריימר לא תקין, ולרצף המטרה יש הומולוגיה עם רצף שאינו מטרה. —— פרימרים בעיצוב מחדש.

תופעות: להקות ההגברה PCR אינן תואמות את הגודל הצפוי, גדול או קטן, או שלפעמים מתרחשות גם להקות הגברה ספציפיות וגם להקות הגברה לא ספציפיות.

A-1 פריימר

■ סגוליות פריימר ירודה

—— פריימר בעיצוב מחדש.

■ ריכוז הפריימר גבוה מדי —— הגדל כראוי את טמפרטורת הדנטורציה והארך את זמן הדנטורציה.

A-2 Mg²⁺ ריכוז

■ ה- Mg²⁺ הריכוז גבוה מדי —— הפחת כראוי את ריכוז Mg2+: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-3 פולימראז תרמו-יציב

■ כמות אנזים מוגזמת —— הפחיתו את כמות האנזים כראוי במרווחים של 0.5 U.

A-4 טמפרטורת חישול

■ טמפרטורת החישול נמוכה מדי —— הגדילו כראוי את טמפרטורת החישול או אמצו את שיטת החישול הדו-שלבית

A-5 מחזורי PCR

■ יותר מדי מחזורי PCR —— צמצם את מספר מחזורי ה- PCR.

A-1 פריימר—— ספציפיות ירודה —— עיצוב מחדש של הפריימר, שנה את המיקום והאורך של הפריימר כדי לשפר את הספציפיות שלו; או לבצע PCR מקונן.

A-2 תבנית DNA

—— התבנית אינה טהורה —— לטהר את התבנית או לחלץ DNA בעזרת ערכות טיהור.

A-3 Mg²⁺ ריכוז

—— מג²⁺ הריכוז גבוה מדי —— הפחת כראוי של Mg²⁺ ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-4 dNTP

—— ריכוז ה- dNTP גבוה מדי —— הפחית את ריכוז ה- dNTP כראוי

A-5 טמפרטורת חישול

—— טמפרטורת חישול נמוכה מדי —— הגדילו כראוי את טמפרטורת החישול

A-6 מחזורים

—— יותר מדי מחזורים —— אופטימיזציה של מספר המחזורים

השלב הראשון הוא לבחור את הפולימראז המתאים. פולימראז רגיל של Taq לא יכול לקרוא הגהה בגלל חוסר בפעילות אקסנוקלאז 3'-5 ', ואי התאמה תפחית מאוד את יעילות ההרחבה של שברים. לכן, פולימראז רגיל של Taq לא יכול להגביר ביעילות שברי מטרה הגדולים מ -5 קילו. יש לבחור Taq פולימראז עם שינוי מיוחד או פולימראז אחר באיכות גבוהה כדי לשפר את יעילות ההרחבה ולענות על הצרכים של הגברה של שברים ארוכים. בנוסף, הגברה של שברים ארוכים דורשת גם התאמה מקבילה של עיצוב הפריימר, זמן דנטורציה, זמן הארכה, pH מאגר וכו 'בדרך כלל, פריימרים עם 18-24 bp יכולים להוביל לתשואה טובה יותר. על מנת למנוע נזק לתבנית, יש להפחית את זמן הדנטורציה ב 94 ° C ל -30 שניות או פחות לכל מחזור, והזמן לעלות טמפרטורה ל 94 ° C לפני ההגברה צריך להיות פחות מדקה אחת. יתר על כן, הגדרת טמפרטורת ההרחבה על כ 68 ° C ועיצוב זמן ההארכה לפי הקצב של 1 קילו־בייט/דקה יכולים להבטיח הגברה יעילה של שברים ארוכים.

ניתן להפחית את שיעור השגיאות של הגברה PCR באמצעות פולימראזות שונות של DNA בנאמנות גבוהה. בין כל הפולימראזות של Taq DNA שנמצאו עד כה, לאנזים Pfu יש שיעור השגיאות הנמוך ביותר והנאמנות הגבוהה ביותר (ראו טבלה מצורפת). בנוסף לבחירת האנזים, חוקרים יכולים להפחית עוד יותר את שיעור המוטציות של ה- PCR על ידי ייעול תנאי התגובה, כולל ייעול הרכב החיץ, ריכוז פולימראז יציב ואופטימיזציה של מספר מחזור ה- PCR.