ערכת PCR Blood Direct

הגברה מהירה של גן המטרה ישירות באמצעות דם כתבנית ללא מיצוי.

ערכה זו מאמצת פולימראז דנ"א אנטי מעכב מהונדס גנטית כדי להגביר ביעילות גנים של העתק יחיד בגנום האנושי. מערכת המאגר המותאמת היטב בערכה זו מסייעת לפולימראז להתנגד בתוקף לעיכוב של מעכבי PCR, ובכך יכולה להעצים ישירות DNA באמצעות דם ותאים מתורבתים כתבניות. מוצר זה קל לתפעול ואינו דורש שלבים מסובכים כגון טיהור DNA או טיפול מקדים של דגימות.
ערכה זו מסופקת כ- 2 × MasterMix, וניתן לבצע את התגובה על ידי הוספת תבנית הדם ופריימרים לאיתור המתאימים. ניתן ליישם אותו על התאים המתורבתים של יונקים כגון בני אדם, עכברים, חזירים, בקר ומינים אחרים, כמו גם דם מלא טרי או 4 אינץ 'מוגן, קרישת דם (EDTA, ציטראט, הפרין), קרישי דם נוזלים וכתמי דם יבשים. מאוחסן בכרטיסי המסחר של Whatman 903 ו- FTA Elute.

חתול. לא	גודל האריזה
4992529	20 μl × 100 rxn
4992530	20 μl × 500 rxn

שלח לנו מייל

פרטי המוצר

דוגמא ניסיונית

שאלות נפוצות

תגי מוצר

מאפיינים

■ פשוט ומהיר: ניתן לבצע הגברה PCR ישירות באמצעות דם כתבנית, ללא צורך בשלבים המייגעים של הכנת דגימות וחילוץ DNA.
■ טוהר גבוה: דילוג על שלבי טיפול מוקדם ודגימת חילוץ DNA יכול לסייע במניעת זיהום צולב של דגימות.
■ תפוקה גבוהה: ניתן לבצע זיהוי PCR לדגימות בקנה מידה גדול על ידי שילוב הערכה עם לוחות PCR 96/384 באר.
■ אוניברסאליות חזקה: ערכה זו יכולה להגביר ביעילות שברי GC גבוהים או שברים בעלי מבנה משני מורכב, ואורך ההגברה יכול להגיע עד 5 קילוגרם.
■ עמידות בפני מתח רב: ניתן ליישם ערכה זו עבור מינים שונים ודגימות דם השמורות בדרכים שונות.

יישומים

מוצרי ה- PCR של ערכה זו מכילים "A" בקצה 3', שניתן להשתמש בהם ישירות לשכפול וקטורי TA. ערכה זו יכולה לשמש להגברה של שברי DNA גנומיים, ניתוח גנטי בעל תפוקה גבוהה וניתוח גנוטיפי (כגון זיהוי גנים).

ניתן להתאים את כל המוצרים עבור ODM/OEM. לפרטים,אנא לחץ על שירות מותאם אישית (ODM/OEM)

קודם: ערכת TIANcombi DNA Lyse & Det PCR

הַבָּא: ערכת PCR ישירה של רקמות עכבר

	תוך שימוש בנוגדי קרישה אנושיים של EDTA כתבנית, 4 גנים עם תוכן GC שונה הוגברו על ידי ערכת PCR Blood Direct. מערכת תגובת ה- PCR הייתה 20 μl, ו -1 μl דם שימש כתבנית. M: TIANGEN Marker II; 1: גודל שבר 1090 bp, תכולת GC 68.1%; 2: גודל שבר 1915 bp, תכולת GC 70.4%; 3: גודל שבר 448 bp, תכולת GC 74.8%; 4: גודל שבר 1527 bp, תכולת GC 61.5%. תוצאות ניסוי: ערכת PCR Blood Direct יכולה להגביר ביעילות שברי DNA עם תוכן GC בטווח של 61.5%-74.8%, דבר המצביע על כך שהוא מסוגל להגביר שברי GC גבוהים.
	שימוש בנוגדי קרישה אנושיים של EDTA כתבנית, 5 גנים באורכים שונים (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 ו- Hn4.0) הועצמו על ידי ערכת PCR Direct Blood. מערכת תגובת ה- PCR הייתה 20 μl, ו -1 μl דם שימש כתבנית. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 דגימות דם שונות; NTC: שליטה ללא פריימרים. תוצאות ניסוי: ערכת PCR Blood Direct יכולה להגביר שברים באורך של עד 4 קילו־בייט, דבר המצביע על כך שהוא מסוגל להגביר שברים ארוכים.
	שימוש בנוגדי קרישה אנושיים של EDTA כתבנית, ערכת PCR Blood Direct שימשה לאיתור PCR של דגימות דם שונות. מערכת תגובת ה- PCR הייתה 20 μl, ו -1 μl דם שימש כתבנית. M: TIANGEN Marker II; 1-9: כמות הטעינה של דם היא 0.1 μl, 0.2 μl, 0.3 μl, 0.4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl ו- 5 μl, בהתאמה; NTC: שליטה ללא תבנית תוצאות ניסוי: ערכת PCR Blood Direct יש עמידות חזקה לדם והיא יכולה להגביר דגימות דם בטווח הטעינה של 0.1-5 μl.
	דגימות דם ממין אדם, חולדה, עוף ומינים אחרים עם טיפולים שונים שימשו כתבניות. ערכת PCR Blood Direct שימשה להגברת PRNP (אנושי, 750 bp), אקטין (חולדה, 200 bp) ו- β-Actin (עוף, 1.0 kb). מערכת תגובת ה- PCR הייתה 20 μl, ו -1 μl דם שימש כתבנית. M: TIANGEN Marker II. תוצאות ניסוי: ניתן ליישם ערכת PCR Blood Direct על מגוון רחב של דגימות, וניתן לבצע את זיהוי ה- PCR הישיר על דגימות דם ממינים שונים עם טיפולים שונים.

ש: אין להקות הגברה

תבנית A-1

■ התבנית מכילה זיהומי חלבון או מעכבי טאק וכו '—— לטהר תבנית DNA, להסיר זיהומי חלבון או לחלץ DNA תבנית עם ערכות טיהור.

■ גילוי התבנית אינו שלם —— הגדילו את טמפרטורת הדנטורציה כראוי והאריכו את זמן ההפנמה.

■ התדרדרות התבנית —— הכינו מחדש את התבנית.

A-2 פריימר

■ איכות ירודה של פריימרים —— סינתזה מחדש של הפריימר.

■ הפחתת פריימר —— חלקו את הפריימרים בריכוז גבוה לנפח קטן לשימור. הימנע מהקפאה והפשרה מרובות או קריו-שימור לטווח ארוך של 4 מעלות צלזיוס.

■ תכנון לא נכון של פריימרים (למשל אורך פריימר לא מספיק, דימר נוצר בין פריימרים וכו ') -עיצוב פריימרים מחדש (הימנע מהיווצרות דימר פריימר ומבנה משני)

A-3 Mg²⁺ריכוז

■ מג²⁺ הריכוז נמוך מדי —— הגדל כראוי Mg²⁺ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-4 טמפרטורת חישול

■ טמפרטורת החישול הגבוהה משפיעה על כריכת הפריימר והתבנית. —— הפחית את טמפרטורת החישול וייעל את המצב בשיפוע של 2 ° C.

זמן הארכה A-5

■ זמן הארכה קצר —— הגדל את זמן ההארכה.

ש: חיובי שווא

תופעות: דגימות שליליות מציגות גם את להקות רצף היעד.

זיהום A-1 של PCR

■ זיהום צולב של רצף המטרה או מוצרי ההגברה —— בזהירות לא להעביר את המדגם המכיל את רצף המטרות בדגימה השלילית או לשפוך אותן מהצינור הצנטריפוגות. יש לבצע חיטוי של הריאגנטים או הציוד כדי לסלק חומצות גרעין קיימות, ולקבוע את קיומה של זיהום באמצעות ניסויי בקרה שליליים.

■ זיהום מגיב —— סלק את הריאגנטים ושמור בטמפרטורה נמוכה.

A-2 פרייםr

■ מג²⁺ הריכוז נמוך מדי —— הגדל כראוי Mg²⁺ ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

■ עיצוב פריימר לא תקין, ולרצף המטרה יש הומולוגיה עם רצף שאינו מטרה. —— פרימרים בעיצוב מחדש.

ש: הגברה לא ספציפית

תופעות: להקות ההגברה PCR אינן תואמות את הגודל הצפוי, גדול או קטן, או שלפעמים מתרחשות גם להקות הגברה ספציפיות וגם להקות הגברה לא ספציפיות.

A-1 פריימר

■ סגוליות פריימר ירודה

—— פריימר בעיצוב מחדש.

■ ריכוז הפריימר גבוה מדי —— הגדל כראוי את טמפרטורת הדנטורציה והארך את זמן הדנטורציה.

A-2 Mg²⁺ ריכוז

■ ה- Mg²⁺ הריכוז גבוה מדי —— הפחת כראוי את ריכוז Mg2+: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-3 פולימראז תרמו-יציב

■ כמות אנזים מוגזמת —— הפחיתו את כמות האנזים כראוי במרווחים של 0.5 U.

A-4 טמפרטורת חישול

■ טמפרטורת החישול נמוכה מדי —— הגדילו כראוי את טמפרטורת החישול או אמצו את שיטת החישול הדו-שלבית

A-5 מחזורי PCR

■ יותר מדי מחזורי PCR —— צמצם את מספר מחזורי ה- PCR.

ש: להקות מדבקות או מריחות

A-1 פריימר—— ספציפיות ירודה —— עיצוב מחדש של הפריימר, שנה את המיקום והאורך של הפריימר כדי לשפר את הספציפיות שלו; או לבצע PCR מקונן.

A-2 תבנית DNA

—— התבנית אינה טהורה —— לטהר את התבנית או לחלץ DNA בעזרת ערכות טיהור.

A-3 Mg²⁺ ריכוז

—— מג²⁺ הריכוז גבוה מדי —— הפחת כראוי של Mg²⁺ ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-4 dNTP

—— ריכוז ה- dNTP גבוה מדי —— הפחית את ריכוז ה- dNTP כראוי

A-5 טמפרטורת חישול

—— טמפרטורת חישול נמוכה מדי —— הגדילו כראוי את טמפרטורת החישול

A-6 מחזורים

—— יותר מדי מחזורים —— אופטימיזציה של מספר המחזורים

ש: כמה DNA צריך להוסיף במערכת תגובת PCR של 50 μl?

ש: איך מגבירים שברים ארוכים?

השלב הראשון הוא לבחור את הפולימראז המתאים. פולימראז רגיל של Taq לא יכול לקרוא הגהה בגלל חוסר בפעילות אקסנוקלאז 3'-5 ', ואי התאמה תפחית מאוד את יעילות ההרחבה של שברים. לכן, פולימראז רגיל של Taq לא יכול להגביר ביעילות שברי מטרה הגדולים מ -5 קילו. יש לבחור Taq פולימראז עם שינוי מיוחד או פולימראז אחר באיכות גבוהה כדי לשפר את יעילות ההרחבה ולענות על הצרכים של הגברה של שברים ארוכים. בנוסף, הגברה של שברים ארוכים דורשת גם התאמה מקבילה של עיצוב הפריימר, זמן דנטורציה, זמן הארכה, pH מאגר וכו 'בדרך כלל, פריימרים עם 18-24 bp יכולים להוביל לתשואה טובה יותר. על מנת למנוע נזק לתבנית, יש להפחית את זמן הדנטורציה ב 94 ° C ל -30 שניות או פחות לכל מחזור, והזמן לעלות טמפרטורה ל 94 ° C לפני ההגברה צריך להיות פחות מדקה אחת. יתר על כן, הגדרת טמפרטורת ההרחבה על כ 68 ° C ועיצוב זמן ההארכה לפי הקצב של 1 קילו־בייט/דקה יכולים להבטיח הגברה יעילה של שברים ארוכים.

ש: כיצד לשפר את נאמנות ההגברה של PCR?

ניתן להפחית את שיעור השגיאות של הגברה PCR באמצעות פולימראזות שונות של DNA בנאמנות גבוהה. בין כל הפולימראזות של Taq DNA שנמצאו עד כה, לאנזים Pfu יש שיעור השגיאות הנמוך ביותר והנאמנות הגבוהה ביותר (ראו טבלה מצורפת). בנוסף לבחירת האנזים, חוקרים יכולים להפחית עוד יותר את שיעור המוטציות של ה- PCR על ידי ייעול תנאי התגובה, כולל ייעול הרכב החיץ, ריכוז פולימראז יציב ואופטימיזציה של מספר מחזור ה- PCR.

כתוב את הודעתך כאן ושלח אלינו