2 × Pfu PCR Mix

פולימראז Taq DNA טהור אמונה במיוחד.

פולימראז DNA של Pfu בא לידי ביטוי מ- E. coli עם הגן Pyrococus Furiosis DNA Polymerase המשוכפל ומטהר ומופרד על ידי טיהור עמודים מרובים. מכיוון של- Pfu יש פעילות אקס-נוקלאז 3'-5 ', היא יכולה לקרוא הגהה בתהליך הגברת ה- DNA, בעוד פולימראז מסורתי של Taq DNA לא יכול. למרות שלפולימראזות אחרות של Taq DNA כגון Vent, Deep Vent, Tli, UITma וכו 'יש פונקציות הגהה, ל- Pfu יש את שיעור חוסר ההתאמה הנמוך ביותר מבין כל פולימראסות ה- Taq DNA שנמצאו עד כה. ל- Pfu DNA Polymerase יש יציבות תרמית טובה יותר מאשר פולימראז Taq DNA נפוץ, והוא יכול לשמור על יותר מ -90% פעילות ב -95 מעלות צלזיוס למשך שעה.

תערובת PCU PCR עם צינור אחד (אישור מוצר הייטק לאומי)

■ תערובת ה- Pfu PCR משפרת את הספציפיות והרגישות של תגובת ה- PCR ויכולה להגביר תבניות מורכבות עם תוכן GC גבוה, מבנה משני וכדומה. ניתן להעצים עד 2 עותקים של תבנית היעד, המבטיחה תוצאות ניסיוניות מדויקות יותר.

■ הנוסחה הייחודית של Pfu MasterMix הופכת את כל מערכת התגובה ליציבה מאוד, והפעילות לא תושפע מהקפאה חוזרת ונשנית או מאחסון לטווח ארוך ב -4 מעלות צלזיוס.

■ הפתרון היציב והיעיל המוכן מראש של תערובת PCR יכול להפוך את הפעולה למהירה ופשוטה, ולהפחית מאוד את עוצמת העבודה וטעות הדגימה. משפר PCR וביצועי אופטימיזציה גבוהים כלולים גם הם בתמהיל, מה שמקטין את הדרישות לתנאי ה- PCR.

■ למוצר זה יש מערכות המכילות צבע וגם נטולות צבע. ניתן לערוך אלקטרופורזה ישירות של מוצרי PCR Mix המכילים צבע, ללא הוספת מאגר מדגם.

חתול. לא	גודל האריזה
4992780	1 מ"ל
4992781	5*1 מ"ל
4992782	1 מ"ל
4992906	5*1 מ"ל

שלח לנו מייל

פרטי המוצר

זרימת עבודה

שאלות נפוצות

תגי מוצר

הגדרת פעילות

הפעילות של 1 יחידה (U) Pfu DNA פולימראז מוגדרת ככמות האנזים הנדרשת לשילוב של 10 nmol deoxynucleotides בחומרים בלתי מסיסים בחומצה ב 74 ° C תוך 30 דקות תוך שימוש ב- DNA זרע סלמון מופעל כתבנית/פריימר.

בקרת איכות

הטוהר על ידי זיהוי SDS-PAGE הוא יותר מ- 99%; לא זוהתה פעילות של נוקלאז אקסוגני; ניתן להעצים גן העתק יחיד בגנום האנושי; אין שינוי משמעותי בפעילות כאשר הוא מאוחסן בטמפרטורת החדר למשך שבוע.

פרמטרים טכניים עיקריים

יש לו פעילות אקסו-נוקלאז 3'-5 'ואין פעילות אקס-נוקלאז 5'-3''א. מהירות ההארכה של הגברת ה- DNA נמוכה יותר מזו של טאק פולימראז, ובאופן כללי מהירות ההארכה של אנזים Pfu היא 0.5-1 קילוגרם לדקה. היציבות התרמית של Pfu טובה יותר מ- Taq. עבור תבניות עם תוכן GC גבוה, ניתן להעלות את טמפרטורת הדנטורציה ל -98 ° C, דבר שאין לו השפעה על פעילות פולימראז Pfu. המוצר PCR הוא בקצה בוטה, שניתן להוסיף אותו עם תלות 3'-dA לפני הקשירה עם וקטור TA או שיבוט עם וקטור בוטה.

יישומים

ניתן להשתמש בו להגברה נאמנה של DNA, כגון שיבוט ביטוי גנים, מוטציה מכוונת אתרים, ניתוח פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP) ותיקון סיום.

ניתן להתאים את כל המוצרים עבור ODM/OEM. לפרטים,אנא לחץ על שירות מותאם אישית (ODM/OEM)

קודם: ערכת מוטוגנזה מהירה לאתר

הַבָּא: ערכת PCR Ultra HiFidelity

השתמש ב- DNA גנומי כתבנית להגברת שבר 1 קילו -בתים.
לאחר תגובת ה- PCR, קח 5 μl לגילוי אלקטרופורזה.

ש: אין להקות הגברה

תבנית A-1

■ התבנית מכילה זיהומי חלבון או מעכבי טאק וכו '—— לטהר תבנית DNA, להסיר זיהומי חלבון או לחלץ DNA תבנית עם ערכות טיהור.

■ גילוי התבנית אינו שלם —— הגדילו את טמפרטורת הדנטורציה כראוי והאריכו את זמן ההפנמה.

■ התדרדרות התבנית —— הכינו מחדש את התבנית.

A-2 פריימר

■ איכות ירודה של פריימרים —— סינתזה מחדש של הפריימר.

■ הפחתת פריימר —— חלקו את הפריימרים בריכוז גבוה לנפח קטן לשימור. הימנע מהקפאה והפשרה מרובות או קריו-שימור לטווח ארוך של 4 מעלות צלזיוס.

■ תכנון לא נכון של פריימרים (למשל אורך פריימר לא מספיק, דימר נוצר בין פריימרים וכו ') -עיצוב פריימרים מחדש (הימנע מהיווצרות דימר פריימר ומבנה משני)

A-3 Mg²⁺ריכוז

■ מג²⁺ הריכוז נמוך מדי —— הגדל כראוי Mg²⁺ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-4 טמפרטורת חישול

■ טמפרטורת החישול הגבוהה משפיעה על כריכת הפריימר והתבנית. —— הפחית את טמפרטורת החישול וייעל את המצב בשיפוע של 2 ° C.

זמן הארכה A-5

■ זמן הארכה קצר —— הגדל את זמן ההארכה.

ש: חיובי שווא

תופעות: דגימות שליליות מציגות גם את להקות רצף היעד.

זיהום A-1 של PCR

■ זיהום צולב של רצף המטרה או מוצרי ההגברה —— בזהירות לא להעביר את המדגם המכיל את רצף המטרות בדגימה השלילית או לשפוך אותן מהצינור הצנטריפוגות. יש לבצע חיטוי של הריאגנטים או הציוד כדי לסלק חומצות גרעין קיימות, ולקבוע את קיומה של זיהום באמצעות ניסויי בקרה שליליים.

■ זיהום מגיב —— סלק את הריאגנטים ושמור בטמפרטורה נמוכה.

A-2 פרייםr

■ מג²⁺ הריכוז נמוך מדי —— הגדל כראוי Mg²⁺ ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

■ עיצוב פריימר לא תקין, ולרצף המטרה יש הומולוגיה עם רצף שאינו מטרה. —— פרימרים בעיצוב מחדש.

ש: הגברה לא ספציפית

תופעות: להקות ההגברה PCR אינן תואמות את הגודל הצפוי, גדול או קטן, או שלפעמים מתרחשות גם להקות הגברה ספציפיות וגם להקות הגברה לא ספציפיות.

A-1 פריימר

■ סגוליות פריימר ירודה

—— פריימר בעיצוב מחדש.

■ ריכוז הפריימר גבוה מדי —— הגדל כראוי את טמפרטורת הדנטורציה והארך את זמן הדנטורציה.

A-2 Mg²⁺ ריכוז

■ ה- Mg²⁺ הריכוז גבוה מדי —— הפחת כראוי את ריכוז Mg2+: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-3 פולימראז תרמו-יציב

■ כמות אנזים מוגזמת —— הפחיתו את כמות האנזים כראוי במרווחים של 0.5 U.

A-4 טמפרטורת חישול

■ טמפרטורת החישול נמוכה מדי —— הגדילו כראוי את טמפרטורת החישול או אמצו את שיטת החישול הדו-שלבית

A-5 מחזורי PCR

■ יותר מדי מחזורי PCR —— צמצם את מספר מחזורי ה- PCR.

ש: להקות מדבקות או מריחות

A-1 פריימר—— ספציפיות ירודה —— עיצוב מחדש של הפריימר, שנה את המיקום והאורך של הפריימר כדי לשפר את הספציפיות שלו; או לבצע PCR מקונן.

A-2 תבנית DNA

—— התבנית אינה טהורה —— לטהר את התבנית או לחלץ DNA בעזרת ערכות טיהור.

A-3 Mg²⁺ ריכוז

—— מג²⁺ הריכוז גבוה מדי —— הפחת כראוי של Mg²⁺ ריכוז: ייעל את ה- Mg²⁺ ריכוז על ידי סדרה של תגובות מ- 1 מ"מ עד 3 מ"מ עם מרווח של 0.5 מ"מ כדי לקבוע את ה- Mg האופטימלי²⁺ ריכוז לכל תבנית ופריימר.

A-4 dNTP

—— ריכוז ה- dNTP גבוה מדי —— הפחית את ריכוז ה- dNTP כראוי

A-5 טמפרטורת חישול

—— טמפרטורת חישול נמוכה מדי —— הגדילו כראוי את טמפרטורת החישול

A-6 מחזורים

—— יותר מדי מחזורים —— אופטימיזציה של מספר המחזורים

ש: כמה DNA צריך להוסיף במערכת תגובת PCR של 50 μl?

ש: איך מגבירים שברים ארוכים?

השלב הראשון הוא לבחור את הפולימראז המתאים. פולימראז רגיל של Taq לא יכול לקרוא הגהה בגלל חוסר בפעילות אקסנוקלאז 3'-5 ', ואי התאמה תפחית מאוד את יעילות ההרחבה של שברים. לכן, פולימראז רגיל של Taq לא יכול להגביר ביעילות שברי מטרה הגדולים מ -5 קילו. יש לבחור Taq פולימראז עם שינוי מיוחד או פולימראז אחר באיכות גבוהה כדי לשפר את יעילות ההרחבה ולענות על הצרכים של הגברה של שברים ארוכים. בנוסף, הגברה של שברים ארוכים דורשת גם התאמה מקבילה של עיצוב הפריימר, זמן דנטורציה, זמן הארכה, pH מאגר וכו 'בדרך כלל, פריימרים עם 18-24 bp יכולים להוביל לתשואה טובה יותר. על מנת למנוע נזק לתבנית, יש להפחית את זמן הדנטורציה ב 94 ° C ל -30 שניות או פחות לכל מחזור, והזמן לעלות טמפרטורה ל 94 ° C לפני ההגברה צריך להיות פחות מדקה אחת. יתר על כן, הגדרת טמפרטורת ההרחבה על כ 68 ° C ועיצוב זמן ההארכה לפי הקצב של 1 קילו־בייט/דקה יכולים להבטיח הגברה יעילה של שברים ארוכים.

ש: כיצד לשפר את נאמנות ההגברה של PCR?

ניתן להפחית את שיעור השגיאות של הגברה PCR באמצעות פולימראזות שונות של DNA בנאמנות גבוהה. בין כל הפולימראזות של Taq DNA שנמצאו עד כה, לאנזים Pfu יש שיעור השגיאות הנמוך ביותר והנאמנות הגבוהה ביותר (ראו טבלה מצורפת). בנוסף לבחירת האנזים, חוקרים יכולים להפחית עוד יותר את שיעור המוטציות של ה- PCR על ידי ייעול תנאי התגובה, כולל ייעול הרכב החיץ, ריכוז פולימראז יציב ואופטימיזציה של מספר מחזור ה- PCR.

כתוב את הודעתך כאן ושלח אלינו